近年来，妇科恶性肿瘤包括子宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢上皮性癌（卵巢癌）在早期诊断和治疗方面取得了一定进展，但仍然面临诸多难题 ^［ 1 ］ 。子宫颈癌的发病率居妇科恶性肿瘤的首位，晚期及复发患者的预后差；子宫内膜癌的早期诊断率虽然较高，但对于复发性和特殊病理类型的治疗依然充满挑战；卵巢癌因早期症状隐匿，多数患者确诊时已是晚期，治疗效果有限。这些妇科恶性肿瘤的高异质性和复杂的肿瘤微环境，使得传统治疗手段有时难以奏效。因此，亟需借助更先进的技术手段以进一步了解这些肿瘤的生物学特性，推动研究成果向临床应用的转化。

传统的高通量测序一般是指批量RNA测序技术，检测的是样本中所有细胞或组织的平均基因表达水平，不能提供单个细胞层级的详细信息。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术通过从单个细胞中提取RNA进行测序，揭示了细胞的异质性 ^［ 2 ］ 。然而，该技术需将细胞从组织中解离，导致原始空间信息的丢失。值得注意的是，细胞在组织中的空间分布直接影响其功能、行为以及与周围细胞和微环境的相互作用。因此，将基因表达与空间信息联系起来的新技术备受期待。空间转录组测序（spatial transcriptomics sequencing，STS）技术通过从完整组织片中获取转录组数据，同时揭示细胞的空间背景和转录模式，在肿瘤研究和微环境分析中具有独特优势 ^{［ 3 , 4 ］} 。STS技术为研究肿瘤细胞的异质性和肿瘤微环境提供了新的视角及方法，有助于深入了解肿瘤发生、发展的机制，并为制定个体化治疗提供依据 ^［ 5 ］ 。STS技术在妇科恶性肿瘤研究中显示出一定的应用前景，本文综述STS技术在妇科恶性肿瘤研究中的应用进展，重点探讨STS技术在揭示肿瘤发生、发展的机制，肿瘤空间异质性、微环境特征及其与疗效的关系等方面的最新研究成果。

STS技术根据组织内特定mRNA分子的空间定位和丰度不同分为基于成像的技术和基于测序的技术 ^［ 6 ］ 。基于成像的技术依赖显微镜对mRNA进行原位成像，包括原位杂交（in situ hybridization，ISH）技术和原位测序（in situ sequencing，ISS）技术，分别通过对mRNA进行荧光标记杂交和直接在组织内进行mRNA测序来获取空间信息。尽管ISS技术的核心原理是测序，但其信号读取依赖荧光显微成像，而非传统的高通量测序，因此，通常被归类为基于成像的STS技术。ISH技术较ISS技术具有更高的mRNA检测效率，而ISS技术在检测更大面积的组织区域有优势。基于测序的技术需先从组织中捕获mRNA，合成cDNA，再通过二代测序技术检测基因的空间表达量，根据其获取空间信息的方式可分为基于显微切割的技术和基于原位条形码的技术。常见STS技术的检测流程见 图1 。

1. ISH技术：ISH技术最早用于基因表达的定性分析，直到单分子RNA荧光原位杂交技术的出现才实现了对探针标记的转录本进行定量分析，并成为基于成像的现代STS技术的基础。目前，常用的ISH技术主要包括：（1）序列荧光原位杂交（sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH）技术：通过每轮使用不同荧光团标记探针，逐轮杂交，能够检测大量的转录本并达到亚细胞分辨率 ^［ 7 ］ 。然而，随着杂交轮次增加，成本和错误率也会增加，通常1次只能靶向100~200个基因。基于seqFISH技术的分子制图技术单次可检测出100个基因，适用于稀有转录本的检测。（2）多重容错性荧光原位杂交（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization，MERFISH）技术：通过二进制编码的二级探针改进了seqFISH技术，显著提高了检测通量并降低了错误率，能够检测数千个RNA分子并精确定位，适合大规模RNA表达图谱的研究 ^［ 8 ］ 。基于MERFISH技术的MERSCOPE平台可对1 cm ³的组织进行亚细胞级超分辨成像（分辨率<100 nm）。虽然MERFISH技术对设备和操作的要求较高，但超高分辨率使其成为高精度研究的理想选择。以上两种技术均存在探针设计难度大、成本和劳动力随着目标读数的数量而增加的弊端 ^［ 9 ］ 。

2. ISS技术：ISS技术是直接将组织或细胞样品中mRNA逆转录为cDNA，利用锁环探针与靶向基因进行杂交，通过滚环扩增放大信号，可用于检测低表达量RNA的空间表达信息。主要包括：（1）空间分辨转录扩增子读数图谱（spatially resolved transcript amplicon readout mapping，STARmap）技术：此技术为ISS技术的改良，采用条形码锁环探针进行杂交，并添加第2个引物以靶向特定位点，从而避免逆转录 ^［ 10 ］ 。STARmap技术能够提供亚细胞层级的高分辨率，同时检测数百至数千个基因的空间表达信息；其优势还在于可对体积较大的完整组织进行测序，但在较厚切片中检测到的转录组信息有限。STARmap技术操作复杂，数据处理难度及成本也较高，故适用于需要精确空间定位的研究，尤其是对于复杂组织、肿瘤和免疫微环境等高异质性研究。（2）荧光原位测序（fluorescent in situ sequencing，FISSEQ）技术：该技术使用非靶向的荧光原位RNA测序方法，可捕获所有种类的RNA。FISSEQ技术具有高敏感度、低误差率及高分辨率成像等优点。与STARmap技术相比，FISSEQ技术还具有较高的通量，更适用于特定基因的空间分布研究、大规模基因表达分析、基因组筛选等。

3. 基于显微切割的技术：该技术通过显微解剖精确捕获特定细胞，提取其RNA进行基因表达分析。主要包括：（1）激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）技术：应用激光束在显微镜下切割拟检测组织区域（直径范围为60~700 μm），精确获取指定解剖区域的标本 ^［ 11 ］ 。LCM技术的分辨率达单细胞水平，适用于对样本类型兼容度较高的分析，如部分降解的组织切片。然而，在捕获和切割过程中，RNA质量和细胞完整性可能难以保证，且LCM技术操作复杂、费时费力，每次只能从组织中提取较小的区域，通量较低，因此，LCM技术常用于小规模样本或特定区域的精细研究。（2）地理位置测序（geographical position sequencing，Geo-seq）技术：结合了LCM与scRNA-seq技术，分辨率达到单细胞水平，但通常只能分析少量的细胞群体（约10个单细胞的组织区域） ^［ 12 ］ ，整体通量较低，因此，Geo-seq技术适用于需要精准捕捉细胞间差异及空间位置信息的研究。

4. 基于原位条形码的技术：此技术使用位置标记（条形码）将组织中每个区域的空间信息编码，从而实现对特定位置基因表达的测定。根据条形码类型可分为固相捕获方法和选择性条形码标记方法，前者是将组织转移到带有预先排列好的DNA条形码的基质上，包括Visium、Slide-seq、高清空间转录组（high definition spatial transcriptomic，HDST）技术等；后者是指DNA条形码从特定的组织位置收集或应用于特定的组织位置，如数字空间分析（digital spatial profiling，DSP）技术等。（1）Visium技术：该技术具有检测通量高、操作简便、数据处理成熟，兼容新鲜和冷冻组织切片及甲醛固定石蜡包埋组织切片等优点 ^［ 13 ］ 。但该技术分辨率（55 μm）低于单细胞水平，限制了对单细胞层级的精细捕获，适合用于揭示组织中的区域性表达模式。（2）Slide-seq技术：较Visum技术能以更高的分辨率（10 μm）检测全基因组表达，并改善新鲜或冷冻组织中3′转录组基因表达的检测 ^［ 14 ］ 。Slide-seq技术的局限性在于捕获率较低，并可能捕获来自多个细胞的转录本 ^［ 15 ］ 。因此，该技术可用于研究复杂组织中的空间基因表达分布、细胞群体之间的基因差异等。（3）HDST技术：具有极高的空间分辨率（1~2 μm），兼具高通量及高空间精度等优点，能捕获丰富的空间信息。该技术对数据分析要求较高，实验成本显著增加，适合组织中需要细胞间精确互动分析的样本，如神经系统或肿瘤微环境研究 ^［ 16 ］ 。（4）DSP技术：该技术的优势在于能同时分析RNA和蛋白质的空间分布，特别适用于大规模、高通量的空间基因与蛋白表达数据整合 ^［ 17 ］ 。然而，该技术分辨率（约为50 μm）及捕获率较低，产生的数据庞大，对数据处理能力要求较高。

STS数据具有高维度性和复杂性。探索性数据分析（exploratory data analysis，EDA）作为生物学数据产生新假设的策略，在STS数据分析中发挥重要作用 ^［ 18 ］ 。EDA通过可视化和统计学方法，揭示潜在的模式、趋势及数据之间的关系，进而指导后续的深入分析和假设检验。EDA主要包括：降维分析、聚类分析、空间可变基因分析等。常用的EDA工具主要包括基于R和Python语言的软件包。（1）Seurat包：是R语言中广泛使用的scRNA-seq分析工具，自Seurat v4包起支持STS数据分析，提供空间基因表达可视化、空间特异基因检测、scRNA-seq与STS数据整合等功能，适用于中等规模数据（如Visium）的分析。Seurat v5包进一步优化了计算速度、数据存储、空间邻域分析，提升了STS与scRNA-seq细胞类型匹配精度，减少了批次效应影响，并支持Visium HD、Slide-seq等大规模STS数据分析。Seurat包的核心优势在于其强大的R语言兼容性，不仅能进行STS和scRNA-seq分析，还能无缝对接Monocle（细胞轨迹推断）、CellChat（细胞通信分析）等R包，拓展了下游分析能力。此外，Seurat包还能结合Bioconductor生态，拓展到基因富集分析、表观遗传调控分析等领域。因此，Seurat包在基因表达分析、细胞类型注释及下游生物学分析等方面具有强大的优势。（2）Scanpy包：是基于Python语言开发的scRNA-seq分析工具，支持基因表达差异分析、空间数据的聚类、降维分析等，具有较高的计算效率，尤其适合超大规模STS数据分析，如MERFISH、空间增强分辨率组学测序（spatial enhanced resolution omics sequencing，Stereo-seq）。与Seurat包相比，Scanpy包在STS与scRNA-seq技术检测中细胞类型整合能力较弱，需依赖Scanorama、scVI等额外工具，而这些工具本质上是针对scRNA-seq数据整合设计的，而不是STS与scRNA-seq整合。Scanpy包的优势在于计算速度快，适合超大规模数据，但其R语言兼容性较弱，进行细胞轨迹推断、细胞通信分析等下游分析时，需要借助Python语言的独立工具（如scVelo、CellRank）。Squidpy是Scanpy的扩展包，提供计算机视觉和空间分析功能，支持组织切片图像处理、细胞邻域分析，适合高级空间组织研究（如病理图像分析）。相比之下，Seurat v5包更专注于基因表达分析。

EDA在STS研究中的作用不可或缺，研究者应根据具体的数据类型和研究目标选择合适的工具进行分析。EDA工具的合理使用，可为后续的深入分析和临床应用提供更为坚实的数据支持。

1. 子宫颈癌：人乳头状瘤病毒（HPV）持续感染是导致子宫颈癌发生、发展的重要原因。然而，其具体的致癌机制仍未被完全揭示。Ou等 ^［ 19 ］ 通过结合单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA-sequencing）和Stereo-seq技术对HPV阳性子宫颈鳞癌样本进行分析，首次展示了HPV感染的空间分布，提示，HPV感染可能通过改变局部免疫状态或调控特定基因表达来驱动肿瘤进展，为HPV感染在肿瘤微环境中的角色提供了新视角，并为早期诊断和针对HPV相关的免疫治疗提供了新的思路。Guo等 ^［ 20 ］ 通过联合scRNA-seq和Visium技术，对9份HPV阴性及阳性样本进行了分析，不仅观察到HPV感染与肿瘤细胞的空间分布相关，还发现致癌基因如CASP14和CALML5基因的显著上调以及从HPV感染到子宫颈癌发生过程中免疫微环境重塑的过程，为分子诊断和靶向治疗提供了潜在的早期标志物和靶点。但样本量较小，结论需进一步验证。

免疫治疗的发展，特别是免疫检查点抑制剂等的应用，虽然为改善子宫颈癌患者的预后带来了新的希望，但其总体反应率仍不理想，仅为4%~26%。STS技术在子宫颈癌免疫微环境研究中的应用，揭示了肿瘤区域异质性及免疫细胞分布，为了解免疫治疗反应不佳的原因提供了重要线索。Ou等 ^［ 19 ］ 分析了HPV阳性子宫颈鳞癌的免疫微环境，发现癌症相关肌成纤维细胞（myCAF）在肿瘤区域形成了免疫屏障，限制了效应性免疫细胞的浸润，并通过过度表达骨膜蛋白（POSTN）和CXC型趋化因子配体6（CXCL6）促进免疫逃逸，这为优化免疫治疗策略、开发癌症相关成纤维细胞（CAF）靶向治疗提供了潜在依据。另外，Fan等 ^［ 21 ］ 的研究通过scRNA-seq、Stereo-seq等技术识别出子宫颈鳞癌中8种不同的基因表达模式（meta-program 1~8，MP1~8），用于肿瘤细胞分类，反映了不同肿瘤内部的异质性模式。其中，MP6主要富集了与角化相关的基因，突出了其鳞癌的特异性特征。MP6呈现肿瘤细胞与免疫细胞浸润互斥的现象，并伴随转化生长因子β信号通路的激活，诱导CAF形成免疫抑制屏障，阻止T淋巴细胞浸润。靶向MP6核心基因的脂肪酸结合蛋白5（FABP5）可显著抑制小鼠移植瘤的生长并增加T淋巴细胞浸润，表明，FABP5是免疫治疗的潜在靶点。此外，该研究定义了MP6/7评分，用于描述每个肿瘤样本中MP6相较于MP7的富集程度，并发现MP6/7评分可作为鳞癌免疫治疗反应的预测指标。基于新辅助化疗联合卡瑞利珠单抗治疗局部晚期子宫颈癌的研究（即NACI研究）中，对21例局部晚期子宫颈癌接受1个疗程新辅助化疗前、后配对样本的批量RNA测序分析表明，新辅助化疗能够有效降低MP6/7评分，且与免疫检查点抑制剂治疗的病理完全缓解率相关 ^［ 22 ］ ，证明了STS技术在肿瘤免疫治疗反应预测中的价值。总之，STS技术揭示了子宫颈癌微环境的空间异质性，并为优化免疫治疗策略提供了重要依据。

2. 子宫内膜癌：STS技术在子宫内膜癌研究中的应用为探索其发病机制和微环境特征提供了新视角。Padilla-Banks等 ^［ 23 ］ 应用scRNA-seq和Visium技术研究了二甲基己烯雌酚暴露对小鼠子宫内膜癌发展的影响，揭示了雌激素暴露在子宫内膜癌变过程中通过对上皮细胞分化的抑制作用以及激活Wnt/β连环蛋白（β-catenin）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，促进子宫内膜癌的发生。尽管小鼠模型与人类在病理方面存在差异，但该研究首次通过STS技术从空间分布角度揭示了雌激素对子宫内膜癌发生的影响，这一发现为雌激素相关子宫内膜癌的预防和早期干预提供了理论依据。在另一项研究中，Dong等 ^［ 24 ］ 通过对公共数据库中1例子宫内膜癌的Visium技术检测结果进行进一步分析，发现雌激素相关基因在不同类型细胞和肿瘤微环境中有着不同的分布模式，例如：雌激素相关基因MUC1和ELF3基因在肿瘤区域及上皮细胞中高表达，而B4GALT1、XBP1和SLC2A1基因在成纤维细胞和内皮细胞中显著上调，这种空间异质性提示，雌激素在子宫内膜癌进展中有多层次调控的作用。然而，该结果依赖于公共数据，且样本量少，需进一步研究验证。

子宫内膜癌是一组异质性肿瘤，STS技术能够解析肿瘤及微环境中的复杂互动，为个体化治疗提供了新的思路 ^［ 25 ］ 。Yu等 ^［ 26 ］ 基于公共数据库中5例子宫内膜腺癌的scRNA-seq技术检测结果及1例Visium技术检测结果，发现肿瘤细胞可能通过中期因子-核仁素信号轴赋予内皮细胞恶性表型，提示其作为潜在治疗靶点的可能性。然而，该数据主要来源于公共数据库，需进一步扩大样本量进行验证。此外，Guo等 ^［ 27 ］ 应用DSP技术对45例错配修复缺陷（MMR-d）型子宫内膜癌进行分析，构建了高分辨率的肿瘤微环境图谱。该研究鉴定了14个特征基因，并据此将患者分为“热”“中”“冷”3种免疫亚型，结果表明，“热”亚型的肿瘤免疫微环境中CD ₈ ⁺肿瘤中浸润淋巴细胞富集，提示该亚型具有较强的抗肿瘤潜力；但伴随的替代活化巨噬细胞（M2型巨噬细胞）和调节性T淋巴细胞浸润可能削弱其临床获益，揭示了免疫微环境在个体化治疗中的潜在影响。这一分类有望用于预测免疫治疗反应，为制定精准治疗方案提供参考。

STS技术也为子宫内膜癌免疫治疗和潜在治疗方法的应用提供了重要支持。Chen等 ^［ 28 ］ 通过scRNA-seq及Slide-seqV2技术研究了2例复发性子宫内膜癌患者在免疫检查点抑制剂治疗中的反应，发现治疗有效者肿瘤微环境中表现出显著的CD ₈ ⁺ T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞富集及更强的配体-受体相互作用，提示，免疫细胞空间分布对免疫治疗效果具有重要影响。这一发现为提高免疫治疗有效率提供了新的研究方向。然而，由于样本量有限且未设置治疗前、后对照，研究结果尚需更多样本量验证。神经导向因子（Netrin-1）作为一种在子宫内膜癌中高表达的胚胎分泌型层黏蛋白相关糖蛋白，STS技术提供了其作为治疗靶点的依据。Cassier等 ^［ 29 ］ 在子宫内膜癌小鼠模型中验证了抗Netrin-1单克隆抗体（NP137）的治疗效果，并结合scRNA-seq和Visium技术分析了NP137治疗前和治疗2个疗程后配对的人子宫内膜癌样本，结果表明，NP137治疗可显著减少肿瘤细胞数量、抑制肿瘤上皮间质转化，并观察到T淋巴细胞与肿瘤细胞相互作用的强度增加，为揭示子宫内膜癌抗Netrin-1治疗的分子机制提供了新的视角。

3.卵巢癌：卵巢癌在妇科恶性肿瘤中的预后最差，5年生存率仅为30%~40%，其中高级别卵巢浆液性癌（HGSOC）是最常见的病理类型，恶性度高。大部分HGSOC起源于输卵管，经历输卵管浆液性上皮内癌，并最终进展为累及邻近卵巢、腹膜软组织和淋巴结等的播散性疾病。STS技术在探索其早期病变和肿瘤进展机制方面显示出重要价值。Wang等 ^［ 30 ］ 应用DSP技术比较了13例输卵管浆液性上皮内癌、12例正常输卵管上皮、3例HGSOC间的基因表达差异，发现了若干关键基因在输卵管浆液性上皮内癌和HGSOC中的特异性激活，特别是IGFBP2基因的高表达。该研究还通过DNA甲基化分析、小鼠模型等进一步验证了IGFBP2基因高表达在卵巢癌前病变及其进展中的作用，提示其可能成为卵巢癌早期筛查的潜在标志物和靶向治疗的候选分子。该研究突出了DSP技术在揭示组织微环境中基因表达差异的优势，有助于深入了解卵巢癌的早期病理过程。

HGSOC表现出高度的遗传不稳定性和亚克隆异质性，且这种异质性已被证明与不良预后相关 ^［ 31 ］ 。STS技术已用于揭示卵巢癌微环境的异质性及其与患者预后的关系。Ferri-Borgogno等 ^［ 32 ］ 使用Visium技术分析4例HGSOC样本，发现短期生存患者的基质簇细胞表达所有CAF标志物，且与较低免疫细胞浸润率及更差预后相关；而长期生存患者的基质簇细胞大多数则仅表达α平滑肌肌动蛋白（SMA）和波形蛋白（Vim），且肿瘤区域伴有更明显的免疫细胞浸润。SMA ⁺ VIM ⁺ PDGFRB ⁺ CAF形成的屏障，阻碍免疫细胞浸润到肿瘤中，从而导致肿瘤细胞免疫逃避。并且，在短期生存患者的肿瘤-间质界面处观察到CAF与肿瘤细胞的相互作用增强，提示，CAF靶向治疗可能是改善HGSOC结局的有效手段。另一项研究中，Xu等 ^［ 33 ］ 应用DSP技术联合成像质谱流式细胞术等揭示了早期和晚期复发HGSOC患者浆细胞与CAF之间的空间关系存在明显差异。该研究发现，浆细胞主要富集于平足蛋白（PDPN）阳性的CAF区域，而早期复发患者的肿瘤微环境中更倾向于出现浆细胞被CAF“隔离”的现象，可能影响其与癌细胞及其他免疫细胞的相互作用，削弱抗肿瘤免疫应答。此外，该研究还发现，PDPN高表达区域富集了与浆细胞分化及募集相关的基因，而三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLS）相关基因主要富集于PDPN低表达区域，提示CAF可能通过影响浆细胞定位及TLS形成，进一步塑造肿瘤免疫微环境，从而影响患者预后。这些研究表明，STS技术能够高分辨率地揭示卵巢癌微环境的空间异质性，并识别特定的细胞-细胞间相互作用的模式，这对于解析CAF介导的免疫逃逸机制至关重要。此外，STS技术提供的空间基因表达信息有助于筛选潜在的生物标志物，为个体化免疫治疗和CAF靶向治疗策略的优化提供科学依据，从而改善HGSOC患者的预后。

化疗耐药是卵巢癌治疗中的重要难题，STS技术在揭示耐药机制方面显示了重要潜力。Stur等 ^［ 34 ］ 采用Visium技术比较了新辅助化疗不同反应的HGSOC样本，发现化疗不敏感组以基质细胞为主，主要为肌成纤维细胞，化疗敏感组则伴有高比例的免疫细胞浸润。提示，细胞空间分布及其相互作用与化疗反应存在关联，但未进一步揭示具体的耐药机制。Han等 ^［ 35 ］ 进一步通过分析3对来自现实及公共数据库中HGSOC化疗耐药与敏感样本的scRNA-seq及STS技术分析结果，识别出与化疗耐药相关的细胞簇及关键基因TACSTD2基因，并揭示了耐药细胞簇通过上皮分泌型磷酸蛋白1（SPP1）和成纤维细胞生长因子（FGF）等信号通路与内皮细胞等的相互作用，阻碍免疫细胞浸润，这一研究为开发新的抗耐药策略提供了依据。鉴于尚缺少包含卵巢透明细胞癌在内的卵巢癌化疗耐药机制研究，Mori等 ^［ 36 ］ 应用Visium技术分析卵巢透明细胞癌耐药机制，发现卵巢透明细胞癌化疗耐药细胞亚群主要分布于肿瘤细胞与CAF的混合区域，并发现化疗耐药与缺氧诱导因子阳性肿瘤细胞与CAF之间的反馈激活有关，填补了卵巢透明细胞癌化疗耐药机制研究的空白，为耐药的克服提供了潜在靶点。

综上，STS技术为妇科恶性肿瘤微环境的研究提供了新的视角，并推动了新型分子标志物和治疗靶点的发现。尽管如此，该技术在应用中仍存在一些局限性，无论是基于成像的技术还是基于测序的技术，都需要昂贵的设备和耗时的实验流程。并且，对于复杂肿瘤组织样本的全面分析，特别是在处理组织厚度较大、细胞多样性高的样本时，STS技术的空间分辨率和数据解析能力仍有待提升。此外，尽管目前STS技术在子宫内膜癌、子宫颈癌和卵巢癌中的应用已取得一定进展，但在其他妇科恶性肿瘤中的研究仍较为有限。展望未来，随着技术的不断创新，尤其是与人工智能的结合，STS技术有望通过提升分辨率、整合多维度信息，进一步推动妇科恶性肿瘤研究的发展，并为精准医疗和个体化治疗策略的制定提供更加坚实的理论依据。